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细胞工程课件

  • 素材大小:12.41 MB
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  • 更新时间:2017-07-23
  • 素材类别:课件PPT
  • 素材格式:.ppt
  • 关键提要:细胞工程
  • 素材版本:PowerPoint2003及以上版本(.ppt)
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这是细胞工程课件,包括了细胞工程的基础知识与基本技术;植物组织培养;悬浮细胞培养和次生代谢物生产;花药及单倍体植株培养;原生质体制备与细胞融合;人工种子制备;植物脱病毒技术;动物细胞与组织培养,动物细胞融合,细胞重构与动物克隆,淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体,染色体转移与基因转移,人类干细胞研究,原核细胞的原生质体融合,真菌细胞的原生质体融合等内容,欢迎点击下载。

PPT预览

细胞工程课件

PPT内容

细  胞  工  程 CELL ENGINEERING
《细胞工程》主要内容(1)
细胞工程的基础知识与基本技术;
植物组织培养;
悬浮细胞培养和次生代谢物生产;
花药及单倍体植株培养;
原生质体制备与细胞融合;
人工种子制备;
植物脱病毒技术;
《细胞工程》主要内容(2)
动物细胞与组织培养
动物细胞融合
细胞重构与动物克隆
淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体
染色体转移与基因转移
人类干细胞研究
原核细胞的原生质体融合
真菌细胞的原生质体融合
参考文献
自编. 细胞工程讲义
罗立新等. 细胞工程. 华南理工大学出版社,2003
李志勇编著. 细胞工程. 科学出版社,2003
探究式自主学习安排(已选)
探究式自主学习安排(2)
细胞工程的三个层次
细胞水平:细胞培养, 细胞融合,整株培养;
细胞器水平:细胞核,染色体,各细胞器;
基因水平:基因转化;
开展细胞工程的意义
研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及其特点;
有利于改变物种的遗传种性,加快选育优良品种的步伐;
可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组织或生物;
有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产;
可获得脱毒植物;
第一章  细胞工程发展简史
植物细胞工程
1935-36 中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长;
1937  美国White发现Vit B促进离体根生长,指出IAA能调控生长;
1937  美国Michel首创用0.5M NaNO3融合两个植物细胞原生质体;
1941  Overbeek以椰子乳加入培养基,成功培养曼佗罗幼胚;
?      Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成,指出腺嘌呤与生长素之比,比例高则生芽,比例低则生根;
植物细胞工程
植物细胞工程
二. 动物细胞工程
动物细胞工程
1940 Earle建立可无限传代的小鼠结缔组织L系;
1951 Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系;
1958 冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合;
1960s 童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植,获核质杂种鱼;
动物细胞工程
第二章 细胞工程的基础知识与基本技术
二.基本操作
基本操作
2.细胞培养
    取样       灭菌       培养       传代        收获
    除菌       取样
3. 细胞融合
    原生质体        融合       筛选
4. 转基因细胞(个体)
第三章  植物细胞工程
第一节 植物组织培养
           在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。
全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种,已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。
植物组织培养过程
植物组培基本过程
配MS培养基
不同植物的最适pH值
预备阶段(2)
选择合适的外植体
外植体大小要适宜;
外植体的部位影响其分化能力和器官分化的类型;
外植体的年龄影响其分化率;
同一植物不同部位的分化需不同的生长素/激动素比例;
不同物种的相同部位外植体分化能力不一样;
预备阶段(3)
除菌
      自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗
外植体
         无菌滤纸吸干                 切割
常用消毒剂的使用和效果
消毒剂      使用浓度/%      清除   消毒时间/min   灭菌效果
次氯酸钠       2                    容易            5~30            很好
次氯酸钙      9~10               容易            5~30            很好
漂白粉       饱和溶液          容易            5~30            很好
升汞           0.1~1                 较难            2~10            最好
酒精           70~75                容易            0.2~2           好
过氧化氢   10~12                最容易        5~15            好
溴水           1~2                    容易            2~10            很好
硝酸银         1                      较难            5~30            好
抗生素      4~50 mg/L         中等            30~60          较好
植物不同器官的消毒和处理
种子
     纯酒精浸10 min,无菌水洗净,次氯酸钙(10%)浸20~30 min,无菌水洗3~5次,无菌滤纸吸干; ;
果实
    纯酒精迅速漂洗,次氯酸钠(2%)浸10 min,无菌水反复冲洗,剥除种子和内部组织;
茎切段
    自来水洗净,纯酒精漂洗,次氯酸钠(2%)浸15~20 min,无菌水洗3次,无菌滤纸吸干;
叶片
   自来水洗净,纯酒精漂洗,升汞(0.1%)浸1min,或次氯酸钠(2%)浸15~20min,无菌水反复冲洗,无菌滤纸吸干; 
诱导去分化形成愈伤组织
添加较高浓度的生长素;
固体培养;
液体培养;
光照培养;
黑暗培养;
形成愈伤组织所需的激素
只需生长素类激素,如菊芋的块茎;
只需细胞分裂素激素,如芜菁根;
需上述两类激素,但有不同比例,多数植物;
还需复杂的天然提取物(椰子乳)等;
生长素类激素
吲哚乙酸(IAA),常用1~10mg/L;
吲哚丁酸(IBA),常用1~5 mg/L;
2,4-D( 2,4-二氯苯氧乙酸),常用10-5~10-7 mol/L;
萘乙酸(NAA),常用1.0 mg/L;
细胞分裂素类激素
激动素(KT)
6-苄氨基嘌呤(6-BA)
玉米素
继代增殖阶段
移植扩增;
分割继代;
光照培养室
生根长芽阶段
生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用,它们的量以及比例的不同配合,对细胞分化起着重要的作用;
外植体本身内源激素水平的差异,导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同;
长芽生根阶段
移栽成活阶段
保湿是关键;
避免强光直射;
温度适宜;
植物组培的优缺点
优点:
A
B
C
D
缺点:
A
B
C
手指玫瑰
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
本方法的历史、现状
1956年,Routier & Nickell首先提出把植物细胞当作工业合成天然产物的途径;
1968年,Reinhard, Corduan & Volks经培养生产出“哈尔碱”(harmine);
1972年,Furuya & Ishii经培养生产出“维斯纳精”(Visnagin);
1981年,Fujita等经培养生产出“紫草素”;
1991年,我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”,达到60mg/L;
目前世界最大的细胞培养罐达20 t;
细胞培养和原植物的天然产物量的比较
从植物培养细胞中获得的各类物质
培养植物细胞制造疫苗
2006年2月,美国Dow  AgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗;
将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中,利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗,以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
悬浮培养
  1.成批培养(封闭式培养)
     优点:易于操作;
                 次生代谢物含量高;
     缺点:效率低;
   2.半连续和连续培养
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
固定化细胞培养
    次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性;
细胞固定化有利于组织化的形成;
细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质和各种物理因素的梯度,这是高产次生代谢物的关键;
细胞固定化有利于对外环境参数进行调控;
细胞固定化有利于回收次生代谢物;
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
平床培养系统
   优点:制作简单;
               能生产较多次生代谢物;
   缺点:占地面积大;
               分化区比例较小;
               02供应受限;
包埋法固定细胞
           将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内,它又分为凝胶包埋法和微胶囊法。
⑴凝胶包埋法固定化(gel immobilization)  ①海藻酸盐(alginate)
β-角叉胶(β-carrageenan)
琼脂糖(agarose)
琼脂(agar)
聚丙烯酰胺(polyacrylamide)
壳聚糖(chitosan)
白明胶(gelatin)
微胶囊法
    微胶囊法是利用天然的或合成的高分子材料作为微囊壁材,包裹成微小球囊,培养基成分和代谢产物等小分子物质可以通过,细胞不能通过,使囊内成为一个微小环境。
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
立柱培养系统
  1.细胞固定化
   琼脂固定细胞
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
褐藻酸钙固定细胞
无菌大量培养植物细胞
                  等量混合→ 注入尼龙网→
配制4%褐藻酸钠,灭菌
氯化钙溶液(2%)浸浴     褐藻酸钙固定的细胞团
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
立柱培养系统
   优点:占地面积小
               次生代谢物产量高
   缺点:制作较复杂
               O2供应受限
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
立柱培养系统操作要素:
取静止期细胞,并使细胞达到一定密度;
控制营养液的成分(包括激素)、浓度及O2供应;
某些种的细胞培养需光照;
尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物(品种);
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
提高次生代谢物产量的途径
生物种性:
    1.选择高产的品系或细胞系;
       目测法,化学分析法,外因选择法;
    2.诱变筛选高产细胞系:
        化学法,物理法;
     3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系;
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
提高次生代谢物产量的途径
培养条件:
   1.培养基:
      A 碳源:常用蔗糖,但应因种摸索;
       B 氮源:常用NO3-和NH4+,(或单用或兼用);
       C 生长调节剂:生长素及细胞分类素。两者 
           的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生
           产具极大影响;
       D 供给目的产物的直接或近直接前体物质;         
第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
提高次生代谢物产量的途径
培养条件:
   2.物理因子:
     A 光质和光量(适量光照);
     B 温度:25~30℃;
     C 通气:底部通气好;
     D pH值:5~6
第三节 植物原生质体制备与融合
植物原生质体研究的意义
有利于进行远缘杂交;
有利于引入生物大分子、细胞器等;
有利于进行细胞操作(核、叶绿体等);
植物原生质体的制备(1)
机械法:
                                                                 高渗处理
植物(外植体,愈伤组织,液培细胞)             质壁分离
机械切割
          原生质体(亚原生质体)
缺点:难,少,分生组织不宜;
植物原生质体的制备(2)
酶解法
  1.酶的购置与纯化
            市售的纤维素酶一般都是复合酶,含:
        纤维素酶C1;
        纤维素酶Cx;
        纤维二糖酶;
        果胶酶;
        磷脂酶;
       核酸酶;
        过氧化物酶;
        酚类;
                 此外,还有蜗牛酶;
植物原生质体的制备(3)
酶解法
  2.取材:干净,高活性
     A 幼嫩的根、茎、叶;
     B 悬浮培养的细胞和体细胞胚;
         无需灭菌,最好同步化;
      C 花粉母细胞和四分体;
         分生能力强,应使用蜗牛酶;
植物原生质体的制备(4)
外植体除菌:
外植体         肥皂水洗           清水洗        酒精
(75%,10s)         次氯酸钠(3%,15min)
无菌水洗3~4次         无菌滤纸吸干  
植物原生质体的制备(5)
外植体酶解
除菌后叶片    撕去下表皮      切块放入反应液
25~30℃
                  不时轻摇        反应液转绿
2~4 h
植物原生质体的制备(6)
外植体酶解
缓冲液:pH值 5.5~5.8
渗透压稳定剂:糖、甘露醇、山梨醇等
膜保护剂:钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸钾(0.3%)
表面活性剂:Tween 80
适当时间
适当温度
植物原生质体的制备(7)
原生质体分离
 过滤法
 离心法(低速)
 漂浮法(不同比重)
植物原生质体的制备(8)
原生质体洗涤
           以新的渗透压稳定剂或培养液轻轻洗涤2~4次;
植物原生质体的制备(9)
原生质体鉴定
  1.直接镜检:
            球形,低渗破裂,荧光增白剂(UV下细胞壁显绿色荧光)
   2.活力测定:
双醋酸荧光素(FDA)染色法:FDA进入细胞,被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不能进入死细胞;
台盼蓝染色:台盼蓝不能进入活细胞;
胞质环流观察;
植物原生质体的培养基
植物原生质体再生培养方法(1)
固体平皿培养法
原生质体悬液2ml         小培养皿
MS培养基配制的1.2% agar 2ml
                                                                                    (25~28℃,
置大皿内(预加湿滤纸)       腊带封口         培养
100~300lux,12h•d-1)                          分化培养基
                                                      愈伤组织                           成苗
植物原生质体再生培养方法(1)
固体平皿培养法
    优点:便于定点观察
                原生质体不易破裂
    缺点:通气较差
                原生质体与琼脂混合不易掌握
                原生质体过于分散
植物原生质体再生培养方法(2)
液体培养法
        原生质体置液体培养基中培养,不时轻摇,能较快生长。细胞团形成后应移到固体培养基中才能继续生长或诱导分化成苗。
缺点:原生质体易受损
            通气较差
            操作较麻烦
植物原生质体再生培养方法(3)
液体浅层培养法(液-固法)
    营养琼脂培养基(0.6%)         小皿凝固
放置无菌滤纸          注入3mL原生质体悬浮液
放大皿内(垫湿滤纸)      封口        保温,光照
(或不光照)       轻摇           愈伤组织         分化培
养基            成苗
植物原生质体再生培养方法(3)
液体浅层培养法(液-固法)
   优点:通气好
               营养均匀
               生长较快
    缺点:需定期添加培养基
                不易更换培养基
植物原生质体再生培养方法(4)
小块液培法
    原生质体悬浮液
     琼脂糖(0.8%)
切小块           置液体培养基中        80~100rpm,
25~28℃         愈伤组织          移放分化培养基
成苗
植物原生质体再生培养方法(4)
小块液培法
    优点:
缺点:
植物原生质体再生培养方法(5)
固体活性炭培养基
    琼脂培养基+1%活性炭
     原生质体悬浮液
平皿培养            成苗
植物原生质体再生培养方法(6)
混合培养(液体或固体培养基)
        将两种原生质体混合培养
有何意义?
植物原生质体融合回顾
植物原生质体融合(1)
化学法诱导融合 (无菌操作)
按一定比例混合双亲原生质体悬液;
吸一份混合液于表面皿上,静置10min;
滴加3份聚乙二醇(PEG)溶液,轻轻摇匀;
    PEG溶液组成:
      PEG  50%(MW=1560~6000)    glucose 0.1mol/L
      CaCl2 10.5 mmol /L             KH2PO4 0.7 mmol /L
      pH 5.5
植物原生质体融合(2)
化学法诱导融合(续前)
25℃保温15~45min,不时轻摇;
滴加1份高钙高pH溶液稀释,摇匀;
    高钙高pH溶液组成:
    glycine 50 mmol /L        CaCl2 50 mmol /L
    glucose 300 mmol /L      pH 10.5
10~15min后,再滴加1份高钙高pH溶液稀释,摇匀;
10~15min后,再加1~2mL原生质体培养液,摇匀;
用20mL原生质体培养液洗5次,间隔5min;
加0.5mL原生质体培养液,微滴培养;
植物原生质体融合(3)
物理法诱导融合
微电极法
            两个微电极尖端分别与两个靠近的原生质体表面接触,用5~12 μA的电流刺激1~5毫秒,促成融合。
平行电极法
             相距200 μm的微电极插入原生质体溶液中,先通入交变电场,使其紧密接触成串珠状;再施以适当电脉冲,原生质体接触区发生可逆击穿而融合;
植物原生质体融合(4)
不对等细胞融合(灭活一方原生质体)
原生质体融合后的产物
融和体的鉴别
杂种细胞筛选
西红柿与马铃薯杂交研究进展
第四节 单倍体植物的诱发与利用
一.单倍体植物的特点:
株矮,叶、花、果小,生活力弱;
高度不育;

第四节 单倍体植物的诱发与利用(2)
二.单倍体植物的利用:
可加快培育新品种;
有利于突变体的选择与利用;

第四节 单倍体植物的诱发与利用(3)
三.诱导产生单倍体植株的途径:
 (一)自然发生
    1.孤雌生殖
    2.孤雄生殖
    3.无融合生殖
第四节 单倍体植物的诱发与利用(4)
三.诱导产生单倍体植株的途径:
  (二)人工诱导:
     1.花药培养:
       1.1选取成熟度适中的花蕾或幼穗 ;
       1.2花药预处理 ;
       1.3选择适当的培养基与培养条件:
       1.3.1 只需简单培养基;
         1.3.2 培养基尚需添加激素;
         1.3.3 培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺;
第四节 单倍体植物的诱发与利用(5)
1.4 培养条件:
      降低气压;
       纯N2密闭处理30~60min,或掺入O2 2.5~5.0%;
       0.5mol/L甘露醇处理2天;
       花药平放;
       适当密植;
第四节 单倍体植物的诱发与利用(6)
1.5 花药单倍体植株的形成途径:
  1.5.1 生殖细胞退化,由营养细胞分裂产生;(常见)
   1.5.2 小孢子细胞不分化成营养细胞和生殖细胞,直接分裂、分化长成;(常见)
   1.5.3 营养细胞和生殖细胞都参与愈伤组织和胚
            的形成;
   1.5.4 仅由生殖细胞分裂形成;
第四节 单倍体植物的诱发与利用(7)
2. 离体花粉培养
挤压法分离花粉;
自然散开法分离花粉;
3.未授粉子房或胚珠的培养
4.杂交法获单倍体植株
第四节 单倍体植物的诱发与利用(8)
5.单倍体植物的加倍
         用秋水仙素(0.2~0.4%)处理24~48h;
加倍方式?
Section 5. Researches on Artificial Seeds 人工种子的研制(1)
人工种子:含有植物胚状体或芽、营养成
分、激素以及其它成分的人工胶囊;
人工种子的构成:
胚状体:由组织培养或细胞培养产生;
人工胚乳:营养物质+激素+农药+抗生素
                        + 除草剂等;
人工种皮:抗压,保水,透气;
Section 5. Researches on Artificial Seeds (2)
Characters of artificial seeds:
不受环境因素制约, 一年四季进行工厂化生产;
有利于保存该种系的优良性状;
成本低,适合于机械化播种;
可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等,以利胚状体的健康生长。
Section 5. Researches on Artificial Seeds (3)
The synchronous growth of embryoid
    胚状体的同步化生长:
低温法
抑制剂法
分离法:分离胚性细胞团;
通气法:通入N2或乙烯;
渗透压法
 ?
Preparation for artificial endosperm
    人工胚乳的制备:
           MS培养基 + 淀粉水解物 + 激素 
         +抗生素 + 农药 + 除草剂 等;
         Any one else?
Section 5. Researches on Artificial Seeds(5)
Embedment of artificial seeds
    人工种子的包埋(滴注法)
胚状体
褐藻酸钠(终浓4%) 混匀
合成胚乳
Section 5. Researches on Artificial Seeds(6)
人工种子的直径由                   决定;
人工种子内含胚状体数目取决于             ;
人工种皮的厚度因                             而定;
Section 5. Researches on Artificial Seeds(7)
人工种子的干燥:
 自然干燥
 人工干燥:22 ± 2℃, 相对湿度70± 5%
   4~6 d ;
胚状体由玻璃状转为不透明表示发育成熟。
第六节  植物脱病毒技术(1)
病毒对植物的危害
植物哪些部位可能没病毒或较少病毒?
植物哪些器官或部位无维管束(或维管束不发达)?
切割外植体时是大些还是小些比较可能获得无毒组织块?
组织块大些还是小些比较容易获得愈伤组织?
第六节  植物脱病毒技术(2)
脱除不同病毒时所取的茎尖大小一样吗?
茎尖很小,实验时应注意哪些问题?
为什么有人喜欢用花瓣来脱病毒?
哪些外因能被用于脱除病毒?
通过培养愈伤组织能脱毒吗?Why?
哪些途径可使脱毒植株不再染毒?
第六节  植物脱病毒技术(3)
植物脱毒检测(4)
植物脱病毒进展(5)
Chapter 3. Animal Cell Engineering 第三章  动物细胞工程
Section 1.Cultivation of Animal Cells and Tissues 第一节  动物细胞与组织培养
细胞系    (Cell line) 原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物,包括:有限细胞系和连续细胞系; 细胞株    (Cell  strain) 通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物;
一.细胞培养
动物细胞培养
Quantitative cultivation of mammal cells 二. 大量培养哺乳动物细胞
动物细胞培养器
Tissues cultivation三. 组织培养
动物表面消毒    获组织               小组织块
Generation of the cultivated cell四. 培养细胞的传代
Non-serum cultivation 五. 无血清培养
六.无血清培养基常用生长因子与激素
Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (1)
微生物污染:
细菌污染;
真菌污染;
支原体污染;
病毒污染
其它细胞污染;
Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (2)
污染来源:
不洁动物标本;
空气:操作室与超净台的过滤设备老化;
器械灭菌不彻底;
人员操作;
血清;
Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (3)
污染物鉴别:
肉眼观察;
光学显微镜观察;
电子显微镜观察;
特殊培养观察:支原体
Keep free from biological contamination 七. 防治污染
Long-term conservation of cell culture 八. 细胞培养物的长期保存
Anabiosis of Cell 细胞复苏
取出安瓿,投入37 ℃ 水浴,轻摇, 重新形成细胞悬液
     (注意防护)
Section 2 Fusion of Animal Cells第二节  动物细胞融合
Animal Cell Fusion Induced by Virus病毒诱导融合
Cell Fusion Induced by Chemicals化学诱导融合
电激诱导融合        
         与植物原生质体相同
Screening Hybrid Cells 杂种细胞筛选
Application of Cell Fusion 细胞融合的应用
Section 3 Monoclonal antibody produced by lymphocyte hybridoma 第三节 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体
Screen of hybridoma 杂交瘤细胞的筛选(1)
Screen of hybridoma 杂交瘤细胞的筛选(2)
如何获得融和细胞?
如何得到单个融和细胞?
鉴别是否分泌所需抗体;
融和细胞的遗传稳定性;
Section 4 Cell Reconstruction & Animal Clone 第四节 细胞重构与动物克隆
一. 细胞核移植
细胞核的制备:
显微操作法
细胞松弛素B处理法
细胞培养                          获得核质体和胞质体
2. 童第周、牛满江等的鱼类移核研究
金鱼与鰟鲏鱼(亚种间)         获中间性状杂种鱼
牛满江教授在海南大学作学术演讲
科学家发现细胞质影响克隆鱼发育新证据
中科院水生所朱作言院士发表在2005年3月美国《繁殖生物学》上的文章“细胞质对来源于转基因鲤鱼的细胞核与金鱼去核卵配合的属间克隆鱼发育的影响”报道:
以转生长激素基因鲤鱼的胚胎细胞核为供体,以金鱼去核未受精卵为受体,进行属间克隆,在总共501枚操作卵中,得到7尾正常发育为成体鱼的属间克隆鱼。克隆鱼的外形特征酷似细胞核供体鲤鱼而不同于受体金鱼,PCR检测和总DNA的RAPD比较分析均证实克隆鱼的核基因组DNA来源于供体鲤鱼;
在血液循环期以前的克隆胚胎中共存着来源于供体和受体两种类型的线粒体DNA,在其后续发育阶段的克隆胚胎直至克隆鱼个体中,仅存在受体细胞质的线粒体DNA;在7尾克隆鱼中,6尾个体的脊椎骨数量是26-28个,1尾个体的脊椎骨数量是31个,而通常鲤的脊椎骨数量是33~36个,金鱼的脊椎骨数量是26~28个。
Clone of mammalian 3. 哺乳动物克隆
Viable offspring derived from fetal and adult mammalian I. Wilmut et al. Nature, 1997, 27, Feb. 385(6619):810-813
Birth of “Dolly”
1997年,维尔穆特用羊乳腺细胞克隆了多莉羊;
     取434个绵羊乳腺细胞的细胞核与同等数量的去核卵电激融合         277个融合细胞(63.8%)         
             移入母羊输卵管发育,成功247个(89.2%)         
             发育到桑葚胚29个(11.7%)        分别植入13只母羊子宫          仅生一只“多莉”(0.23%)
“多莉(Dolly)”的身世
1.从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞,将其放入低浓度的营养培养液中,细胞逐渐停止了分裂,此细胞称之为供体细胞;
2. 从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞,并立即将其细胞核除去,留下一个无核的卵细胞,此细胞称之为受体细胞;
3. 利用电脉冲的方法,使供体细胞和受体细胞发生融合,最后形成了融合细胞,由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应,使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化,从而形成胚胎细胞; 进行早期胚胎发育;
 4.  将早期胚胎转移到苏格兰黑面母绵羊的子宫内,胚胎细胞进一步分化和发育,最后形成一只小绵羊。
Basic pathway for cloning mammalian   克隆哺乳动物基本途径
取出体细胞核                              体外发育
未受精卵去核                易核卵            早期胚胎                                           
                                化学或电激诱导融合
产下幼畜
3. 哺乳动物克隆
1998年后,日、美、新西兰和中国等用体细胞核克隆出鼠、牛、猪、猴、羊等哺乳动物。
2003年5月4日,美国克隆出一只骡。
2003年8月6日意大利科学家宣布以自体克隆的方式克隆出一只小母马;小母马的“妈妈”也是其“姐姐”,也是“自己”。
2003年9月,巴西科学家用意外死亡奶牛的卵泡中的颗粒细胞克隆出正常奶牛;
2003年10月我国山东莱阳农学院克隆牛“双双”经人工授精,产下“健健”,证明克隆牛具正常生殖能力;
我国首例异种克隆北山羊诞生
2004年1月21日在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生中国首例异种克隆动物———克隆北山羊。
将北山羊的体细胞与山羊的卵母细胞结合组成新的胚胎,待胚胎发育到一定阶段移植到发情的母山羊体内。克隆北山羊,雌性,出生重为2.32公斤,体长42厘米,体高35厘米。
在异种克隆研究领域,目前国际上仅有印度野牛和欧洲 盘羊取得成功。
Heterogeneity cloning of panda 异种克隆大熊猫
中科院陈大元研究员提出
如何实施?
目前进展
世界首例成年体细胞克隆水牛2005年3月17日在广西大学“863计划”良种牛南方繁殖中心诞生
2005年4月24日韩国科学家培育出首只克隆狗 “史纳比(snuppy )”
这次研究制造的1095个胚胎只有三个成功受孕,其中一个流产,另一只小狗出生22天后因肺炎死亡,只有史纳比(snuppy )仍然生存,成功率只有0.09% 
我国第一头体细胞克隆猪诞生
意大利克隆成功14头仔猪
国际首例体细胞克隆亚洲黄羊临沂降生
克隆猛犸象?
流产率高;
 难产率高;
 畸形率高;
 围产期死亡率高;
 幼年死亡率高;
Personal Clone   克隆人
克隆技术应该应用于哪些领域 ——新浪网调查
1克隆濒临灭绝的动物            66.32% ;
2克隆人类部分器官用于医疗62.11%;
3克隆国家保护的动物            27.37%;
4创造新的物种                        17.89%;
5克隆可食用的动物                11.58%;
6克隆人类用于生活                  7.37%;
7其它                                          5.26%
坚持克隆人的3位科学家
Clone of human embryo 克隆人类胚胎
英国政府2004年8月向纽卡斯尔大学颁发了世界上第一份克隆人类胚胎的合法执照,批准这所大学进行以医疗为目的的克隆人类胚胎研究。
Section 5 Chromosome Transfer 第五节  染色体转移
Preparation for minicells 微细胞制备
Fusion between minicells and accepted cells 微细胞与受体细胞融合
Directly Chromosome Transfer 直接转移染色体
Chromosome Transfer 染色体转移
Lipidsome packing  脂质体包装法
乙醚:氯仿=1:1
Prescription for chromosome suspension 染色体悬液配方
Section 6 Research on Human Stem Cell 第六节 人干细胞研究
              干细胞是动物(包括人)胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。
Engineering of Stem Cell 干细胞工程
Types of Stem Cells 干细胞的类型
全能性干细胞(胚胎干细胞);
多能性干细胞 ;
专一性干细胞;
Types of Stem Cells (1)
全能性干细胞:
            即受精卵及胚胎干细胞,是最原始的干细胞,具有自我更新、高度增殖和多向分化发育成为人体全部206种组织和细胞甚至形成完整个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时,内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。
Types of Stem Cells (2)
Differentiation of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞分化
Types of Stem Cells (3)
Characters of Stem Cell
 具有分裂成其它细胞的可能性;
 具有无限增殖分裂的潜能;
 可连续分裂几代,也可在较长时间内处
    于静止状态;
 以对称或不对称两种方式进行生长。
Three Steps on the Research of Stem Cell
获得干细胞系 ;
建立干细胞诱导分化模型 ;
将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织,考察其效果。
Three Steps on the Research of Stem Cell (1)
获得干细胞系:
      这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定,且能在体外长期保持干细胞特性(一般应稳定传25代以上);
Three Steps on the Research of Stem Cell (2)
Three Steps on the Research of Stem Cell (3)
Therapy Comparison between Traditional and Stem Cell
  ①低毒性(或无毒性),一次治疗有效;
 ②不需要完全了解疾病发病的确切机理;
 ③用自身干细胞移植,可避免产生免疫 
   排斥反应;
Argue with Stem Cell
Embryo Stem Cell;
Somatic Stem Cell;
坑人?救人?
中国支持治疗性克隆研究
前程无量的干细胞工程
干细胞器官工程的难点
国际领先的徐荣祥
国际领先的徐荣祥
干细胞研究进展(1)
干细胞研究进展(2)
干细胞研究进展(3)
干细胞研究进展(4)
干细胞研究进展(5)
干细胞研究进展(6)
干细胞研究进展(7)
干细胞研究进展(8)
干细胞研究进展(9)
干细胞研究进展(10)
干细胞研究进展(11)
干细胞研究进展(12)
2003年7月上海第二医科大学盛慧珍等培育出包含人兔DNA混合物的人兔混合胚胎干细胞。
2003年9月美国克隆专家扎沃斯将人类的DNA与一头母牛的卵细胞结合后,克隆出“人牛胚胎”,已存活了两星期。(不鼓励)
第七节  动物细胞工程进展
一. 雌核发育
二.阻止卵细胞早期分裂
三. 转基因动物
转基因DNA的制备
转基因动物进展
Routine for artificial uterus manufacture 四.人造子宫研制思路
五.人转基因治疗
复旦大学转基因治血友病(1991)
Chapter 4 Cell Engineering on Microorganisms 第四章  微生物细胞工程
Fusion between prokaryote protoplasts 第一节 原核细胞的原生质体融合
Cell Wall Constitution of Gram-positive Bacteria 2. 革兰氏阴性(G-)细胞壁组成
Lysozyme and its characters 二.溶菌酶及其特性
溶菌酶,恋人的保护神?
Regeneration of Protoplasts 三.原生质体再生
Protoplast Fusion on Gram-positive bacteria 四.革兰氏阳性菌的原生质体融合
HM高渗液
The main steps of Gram-positive bacteria fusion 1.革兰氏阳性菌融合的主要步骤
Factors effecting on the  increasing frequency of fusants 2.提高融合子产生频率的因素
2.提高融合子产生频率的因素
五.Spheroplasts Preparation of Gram-negative bacteria
六. Fusants Screening(1)
六. Fusants Screening(2)
七.计算  Calculation
七.计算  Calculation
Fusion between eukaryote protoplasts 第二节 真核微生物的原生质体融合
1.Yeast Protoplast Preparation
1.Yeast Protoplast Preparation
2. Fusion
Results of Fusion
3.Regeneration of fusants——formation of cell wall
4.Analyses of Fusants
                                            4.Analyses of Fusants 胞质标记分析
4.Analyses of Fusants
二.Protoplast Fusion of        Filamentous fungi (1)
二.Protoplast Fusion of        Filamentous fungi (2)
二.Protoplast Fusion of        Filamentous fungi (3)
二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (4)
二.Protoplast Fusion of         Filamentous fungi (5)
二.Protoplast Fusion of        Filamentous fungi (6)
《细胞工程》复习提要(1)
重视术语概念;
重视无菌操作;
动物及植物细胞培养;
植物细胞次级代谢物生产;
植物组织培养;
植物脱病毒;
单倍体植株培育;
《细胞工程》复习提要(2)
PEG法细胞融合;
融合子筛选的原理;
哺乳动物体细胞克隆;
干细胞研究;
考试时间:5月29日(周日)上午       8:30——10:30
考试地点:博二 203
 

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